簡 介
ADAR酶在RNA中針對位于特定雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的腺苷執(zhí)行A-to-I編輯。ADAR1有兩種亞型——p150和p110，它們通過使用單獨的啟動子和交替剪接產(chǎn)生的。
Fig 1. ADAR editor靶向的雙鏈mRNA環(huán)示例
ADAR1功能喪失突變導(dǎo)致dsRNA傳感器的異常激活。ADAR1在多種腫瘤中高表達，并且ADAR1基因敲除可以改善對特定免疫治療（如PD-1/PD-L1阻斷）的反應(yīng)，并繞過腫瘤免疫治療抵抗機制，這使ADAR1成為治療開發(fā)的具有前景的靶點。
原 理
細胞系含有可作為ADAR1編輯靶標的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于Firefly熒光素酶基因的上游，且包含終止密碼子（UAG），并可在ADAR1介導(dǎo)的編輯下轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼幔║UG）密碼子。
結(jié) 果
ADAR1過表達的HEK293細胞顯示出高熒光素酶活性，此活性在siRNA介導(dǎo)的ADAR1表達敲低后減少。
Fig 2. 三種ADAR1報告基因細胞系的原理
ADAR1報告基因結(jié)構(gòu)包含一個含有終止密碼子（UAG）的ADAR1靶點，該密碼子位于編碼Firefly熒光素酶的序列的上游。在沒有ADAR1的情況下，熒光素酶不會轉(zhuǎn)錄，細胞無熒光素酶活性。在存在ADAR1活性的情況下，腺嘌呤被轉(zhuǎn)化為肌苷，所得的密碼子對應(yīng)氨基酸色氨酸（UUG），從而使熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和表達成為可能。因此，ADAR1活性與熒光素酶活性直接相關(guān)。
選擇HEK293細胞是因為它們的內(nèi)源性ADAR1表達相對較低。
ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）需要轉(zhuǎn)導(dǎo)并穩(wěn)定整合報告基因結(jié)構(gòu)。該細胞需要經(jīng)過轉(zhuǎn)染才能表達ADAR1，并誘導(dǎo)熒光素酶的表達。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）是通過將ADAR1轉(zhuǎn)導(dǎo)到#82238，然后進行抗生素篩選和克隆而生成的。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）是從#82239改造而成，可穩(wěn)定表達Renilla熒光素酶。Renilla熒光素酶活性作為細胞活力的指標，讓用戶在評估化合物對ADAR1活性影響的同時評估其毒性。
Fig 3. ADAR Reporter #2具有最佳的ADAR1響應(yīng)和選擇性。
使用三種報告基因設(shè)計，生成了HEK293 cell pool，并使用轉(zhuǎn)染ADAR1質(zhì)粒的瞬轉(zhuǎn)來篩選敏感性高，響應(yīng)強的細胞系。
鑒于ADAR1和ADAR2的RNA靶標序列存在重疊，ADAR2過表達可能產(chǎn)生的影響。圖3A顯示，三種ADAR報告基因中的兩種在ADAR1過表達時觸發(fā)了熒光素酶活性。其中，ADAR Reporter #2在ADAR2表達時沒有響應(yīng)，與ADAR Reporter #1相比，ADAR Reporter #2對ADAR1具有更好的特異性（圖3B）。因此，選擇ADAR Reporter #2制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。
Fig 4. 穩(wěn)轉(zhuǎn)ADAR1響應(yīng)型報告細胞系對ADAR1有響應(yīng)，對ADAR2無響應(yīng)。
從表達Reporter #2的HEK293 cell pool中選擇穩(wěn)定的、單克隆細胞系。通過瞬轉(zhuǎn)ADAR2或ADAR1的p150或p110亞型，比較熒光素酶活性。
結(jié)果表明，與p110相比，對ADAR1 p150活性的偏好響應(yīng)，ADAR2過表達時檢測到的熒光素酶活性很小。
在21代的穩(wěn)定性測試中，該細胞系一直維持的熒光素酶活性。
為了，通過將ADAR1 p150亞型通過 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到ADAR1響應(yīng)型報告HEK293細胞系中，生成ADAR1過表達HEK293細胞系，可評估ADAR1為靶點的化合物。
ADAR1的siRNA knockdown使熒光素酶活性減少，說明熒光素酶活性來自ADAR1過表達（圖5B）。ADAR1 knockdown并不誘導(dǎo)細胞毒性（圖5C）。因此，細胞死亡并未導(dǎo)致觀察到的熒光素酶活性降低。
將96孔板和384孔板進行比較顯示，與對照組相比，細胞系具有強且穩(wěn)定的信號（圖6）。
Fig 5. ADAR1活性熒光素報告HEK293細胞系中的熒光素酶活性源于ADAR1的表達。
Fig 6. ADAR1過表達的報告基因細胞中ADAR1依賴的熒光素酶活性一致性高。
該細胞系可同時評估ADAR1活性和化合物誘導(dǎo)的細胞毒性。ADAR1活性報告熒光素HEK293細胞系可穩(wěn)定、持續(xù)表達Renilla熒光素酶。Firefly和Renilla熒光素酶活性都與細胞密度相關(guān)（圖7）。
圖7. 在ADAR1活性雙熒光素酶報告基因細胞系中，F(xiàn)irefly熒光素酶和Renilla熒光素酶信號與細胞數(shù)量呈正相關(guān)。
三種細胞系可支持ADAR1研究的不同方面：
ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）可比較ADAR1修飾和突變對ADAR1活性的影響，例如研究結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，或者研究RNA編輯的ADAR1變體。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）穩(wěn)定表達ADAR1，適用于評估ADAR1調(diào)節(jié)劑（如小分子抑制劑）的療效?？蛇M行高通量篩選。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）可在評估靶向ADAR1化合物（如小分子抑制劑）的效力的同時，進行毒性測定。
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更新時間：2024-07-11 
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